Microscopia Virtual
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Técnica histológica
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Fixação – tem por finalidade
conservar os tecidos
com o aspecto mais próximo possível daquele do material vivo. O fixador
mais frequentemente utilizado é o Formol a 10%. O órgão é submerso em
formol e, dependendo da densidade do tecido, do seu tamanho e da
temperatura ambiente, a fixação pode ser mais rápida ou mais lenta.
Após a fixação examinamos a olho nu o material e retiramos os
fragmentos a serem processados e examinados microscopicamente. Os
fragmentos são então acondicionados em pequenas caixas perfuradas de
plástico (cassetes) com a identificação do material tampadas e
entregues ao técnico para processamento.
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Processamento em parafina – tem
por finalidade
retirar a água do tecido e substituí-la por parafina, o que torna o
tecido mais firme e portanto passível de ser cortado em fatias delgadas
(5 m= 5milésimos de milimetro). Isto é feito pela imersão dos cassetesem banhos sucessivos de
álcool (que retira a água mas não se mistura com parafina), de xilol
(que se mistura tanto com o álcool quanto com a parafina) e finalmente
em parafina aquecida (entre 55 e 60o C). Com isto toda a água do tecido é
retirada e substituída por parafina.
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Inclusão – o tecido parafinizado
é incluído em um
pequeno bloco de parafina, com a sua identificação e que é submetido à
microtomia. Fotografar bloco de parafina para colocar aqui.
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Microtomia – consiste em cortar o
bloco de
parafina em fatias muito delgadas. O micrótomo tem um componente em que
o bloco é mantido firmemente preso e alinhado (braço), outro mecanismo
que
movimenta o braço no qual o bloco está preso. Este movimento consiste
em um movimento de subida e descida e em outro de avanço. Cada vez que
o braço contendo o bloco completa um curso, o bloco é submetido à face
afiada de uma navalha de aço e uma fatia delgada de parafina contendo
tecido é cortada. Estes cortes sâo então colocados em um banho maria
histológico, que contém água aquecida, com a finalidade de distender os
cortes, retirando pequenas dobras que se formaram durante a microtomia.
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Coloração e montagem – os cortes
finos (5 micrômetros=5milésimos de milímetro)
que foram obtidos no passo anterior
não podem ser vistos sob o microscópio pois apresentam-se
transparentes. Há necessidade de corá-los para que sejam examinados. A
maior parte das observações histológicas é feita em lâminas coradas
pela hematoxilina e eosina. Um é básico e cora as estruturas ácidas em
azul (que por isso são chamadas de basófiilas) e o outro é ácido e cora
as estruturas básicas (portanto acidófiilas) em
vermelho. Antes de corar as lâminas há necessidade de se retirar a
parafina nos quais os cortes acham-se incluídos. Isto é feito
submetendo-se os cortes, já aderidos à lâmina, a sucessivos banhos em
xilol. A seguir os cortes são submetidos a banhos em álcool em
concentração decrescente até serem hidratados, uma vez que o primeiro
corante (hematoxilina) é uma solução aquosa. Depois disso oa lâmina é
lavada para retirada do excesso de corante e corada com a eosina, aque
pode ser aquosa ou alcoólica. Depois da coloração o
material é novamente desidratado e coberto por uma lamínula de vidro,
que é montada na lâmina com um meio de montagem que tem índice de
refração semelhante ao do vidro.
- Microscopia óptica (de luz)
Microscópio de luz
- Lente ocular (1)
- Revólver das objetivas (2)
- Objetiva (3)
- Parafuso macrométrico (4) para focalização da imagem
- Parafuso micrométrico (5) para focalização da imagem
- Mesa (onde a lâmina é colocada) (6)
- Fonte de luz (7)
- Diafragma e condensador (8)
- Sistema de parafusos para movimentação em dois eixos da mesa com
a lâmina (9)
A microscopia de
luz utiliza a luz para a formação de imagens, em
oposição ao microscópio eletrônico que utiliza feixes de elétrons. Uma
lâmpada é a fonte de luz, que passa por um diafragma íris (que
elimina os raios de luz periféricos), depois passa por um sistema de lentes
(condensador), que concentra a luz em uma pequena área e por um filtro
azul (que torna a luz amarela em luz branca). A luz então atravessa a lâmina
que contem a preparação histológica e alcança a objetiva. Esta é um
sistema de lentes que produz uma ampliação inicial. Normalmente as
objetivas trazem gravadas no seu corpo uma série de informações, entre
elas o número de aumentos que produzem. A objetiva de 100 aumentos é
chamada de objetiva de imersão pois há necessidade de usar uma gota de
óleo de imersão entre a sua extremidade e a lâmina a ser examinada para
que se obtenha o foco. As demais são as objetivas secas pois não
necessitam do óleo.
Depois de formada
a imagem inicial esta é projetada na extremidade da lente ocular que a
amplia outra vez. Para sabermos o valor do aumento final da imagem
basta multiplicarmos o número de aumentos da objetiva, pelo número de
aumentos da lente ocular. Habitualmente a ocular aumenta 10 vezes e a
maior objetiva seca é de 40 aumentos. Com isso geralmente o maior
aumento é de 400 vezes. Com a objetiva de imersão habitualmente temos
1000 aumentos (10 vezes 100).
Os microscópios
binoculares necessitam de um prisma entre a objetiva e a
ocular para projetar a mesma imagem em ambas as oculares.
3. Microscopia virtual
É a técnica de obter, armazenar e transmitir imagens
microscópicas em redes de computadores. As imagens são obtidas através
de microscópios ópticos acoplados a scaners digitais Isto permite
observação independente das imagens por um grande número de pessoas em
localidades diversas. Esta técnica une técnicas de microscopia e de
tecnologia digital.
As lâminas utilizadas em
microscopia digital são as mesmas utilizadas na microscopia digital e
são escaneadas utilizando-se
um microscópio acoplado a um sistema computadorizado de fotografia digital que fotografa cada
um dos campos microscópicos e depois junta as imagens por meio de
software, otendo assim uma imagem da lâmina inteira na ampliação
escolhida.
No momento da exibição da imagem há necessidade de
um software específico que monta a imagem a partir de diversas pequenas
imagens armazenadas no servidor.
Imaginemos que o piso inteiro do laboratório é a
imagem guardada no servidor. Este piso é formado por muitos quadrados
de cerâmica. Caso nós queiramos olhar uma área pequena deste piso, ela
será coberta por 4 ou 8 quadrados e é isto que o software faz. Ele
busca estes 4 ou 8 quadrados e os "costura" uns aos outros formando a
imagem que desejamos. Quando nós movemos nossa observação para outra
área, ele busca novos quadrados e forma nova imagem.
Observem na captura de tela acima os elementos contidos na página, que exibe uma lâmina de pele do dedo. À esquerda existe uma coluna com uma foto da lâmina completa; logo abaixo há informações sobre a lâmina e uma descrição. Na parte superior direita há um pequeno quadrado com a imagem da lâmina, uma escala de aumentos e uma barra na qual podemos mudar o brilho da imagem. Note que há um retângulo amarelo, que mostra qual área está ampliada na porção maior da tela, onde vemos a lâmina em estudo. Esta imagem pode ser movida em qualquer direção, usando-se o cursor do mouse.
